产品简介：

    Hoechst 33342/PI 双染试剂盒（Hoechst 33342/PI Double Stain Kit）采用 Hoechst 33342 和碘化丙啶（PI）双染的方法以区分凋亡细胞和坏死细胞的试剂盒。

    其检测原理是：细胞核荧光染料 Hoechst 33342 可以穿透细胞膜，嵌入双链 DNA 后释放蓝色荧光。对于正常细胞，其可少许进入细胞膜使其染上低蓝色。而凋亡细胞由于细胞膜通透性增强，从而使得进入凋亡细胞内的 Hoechst 33342 明显多于正常细胞，荧光强度比正常细胞要高。另外，细胞发生凋亡时染色质会固缩，从而使得染料能更有效和聚集的结合于 DNA，并且凋亡细胞膜上的 p-糖蛋白泵功能受损而不能有效的将 Hoechst 33342 排除到细胞外使其在细胞内的积累增加，这些特征都使得凋亡细胞经染色后荧光会比正常细胞明显增强。但细胞核荧光染料 PI 不能穿透细胞膜完整的正常细胞或凋亡细胞，即活细胞对 PI 染料拒染。而对于坏死细胞，其细胞膜的完整性在早期即已丧失，可被 PI染色。

    本试剂盒染色快速方便，可用一步法或者两步法进行染色。使用流式细胞仪检测时，无需稀释等配制过程，也无需再准备其它任何溶液。

操作步骤：

一步法染色

    1. 每个样品收集约 10-100 万细胞于 1.5ml 离心管内，离心弃上清。细胞沉淀用 0.8-1ml 细胞染色缓冲液重悬。 

    2. 加入 5 μL  Hoechst 33342 染色液。

    3. 加入 5 μL  PI 染色液。 

    4. 混匀，冰浴或 4℃孵育 20-30 分钟。 

两步法染色

    1. 每个样品收集约 10-100 万细胞于 1.5ml 离心管内，离心弃上清。细胞沉淀用 0.8-1ml 细胞染色缓冲液重悬。 

    2. 加入 5 μL  Hoechst 33342 染色液，置于 37℃孵育 5-15min。

    3. 置于冰水浴中冷却后，4℃1000g 离心 3-5min，吸除上层染色液。 

    4. 加入 0.8-1ml 细胞染色缓冲液重悬细胞沉淀。 

    5. 加入 5µl PI 染色液，置于冰浴或 4℃，孵育 5-15min。

注意：对于贴壁细胞可以胰酶消化，PBS洗涤后收集细胞沉淀后再进行染色。

染色结果观察 

1. 用流式细胞仪检测红色荧光和蓝色荧光。 

    结果判断：在蓝色荧光对红色荧光的散点图上，可将细胞分为三个群：

    正常细胞：弱蓝色荧光＋弱红色荧光【Hoechst 33342+ /PI+ 】； 

    凋亡细胞：强蓝色荧光＋弱红色荧光【Hoechst 33342++ /PI+ 】；

    坏死细胞：弱蓝色荧光＋强红色荧光【Hoechst 33342+ /PI++ 】。

2. 如果使用荧光显微镜检测，检测前离心沉淀细胞，用 PBS 洗涤一次，再涂片观察红色荧光和蓝色荧光。